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原代細(xì)胞的培養(yǎng)及建系之原代細(xì)胞分離篇

發(fā)布時(shí)間: 2023-09-26  點(diǎn)擊次數(shù): 549次

 上篇寫到原代細(xì)胞的取材,這篇文章說一下原代細(xì)胞的分離制作:


 第二節(jié) 原代細(xì)胞的分離和制作   
     人或動(dòng)物體內(nèi)(或胚胎組織)由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密,不利于各個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長繁殖,即使采用1mm3的組織塊,也只有少量處于周邊的細(xì)胞可能生存和生長,若需獲取大量細(xì)胞,必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開,使細(xì)胞解離出來,常采用的方法如下:   
一、懸浮細(xì)胞的分離方法   

組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料,簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘,若懸液量大,可適當(dāng)延長離心時(shí)間,但速度不能太高,延時(shí)也不能太長,以避免擠壓或機(jī)械損傷細(xì)胞,離心沉淀用無鈣、鎂PBS洗兩次,用培養(yǎng)基洗一次后,調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng),若選用懸液中某些細(xì)胞,常采用離心后的細(xì)胞分層液,因?yàn)椋?jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層,這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。不同比重的分層液的配制和具體分離方法詳見淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)的章節(jié)。   
二、實(shí)體組織材料的分離方法    
對(duì)于實(shí)體組織材料,由于細(xì)胞間結(jié)合緊密,為了使組織中的細(xì)胞充分分散,形成細(xì)胞懸液,可采用機(jī)械分散法(物理裂解)和消化分離法。   
(一)機(jī)械分散法   
所取材料若纖維成分很少,如腦組織,部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細(xì)胞或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)(用九號(hào)針),使細(xì)胞通過針頭壓出,或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠(常用注射器鈍端)使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細(xì)胞雖然簡便、快速,但對(duì)組織機(jī)械損傷大,而且細(xì)胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。   
(二)消化分離法   
組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊(或糊狀),應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng),使團(tuán)塊膨松,由塊狀變成絮狀,此時(shí)再采用機(jī)械法,用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩,使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散,制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液,接種培養(yǎng)后,細(xì)胞容易貼壁生長。   
1
、酶消化分離法   
        
酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶,其分離方法如下:   
1 胰蛋白酶分散技術(shù)    
胰蛋白酶(簡稱胰酶)是廣泛應(yīng)用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品,對(duì)蛋白質(zhì)有水介作用,主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開,在常用的蛋白酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同,對(duì)細(xì)胞的消化能力也不同,胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的作用,取決于細(xì)胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無機(jī)鹽離子、pH以及消化時(shí)間的長短等。   
細(xì)胞類型 胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織,能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對(duì)含結(jié)締組織較豐富的組織, 乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等就無效,但若與膠原酶合用,就能增加其對(duì)組織的分離作用。   
酶的活力 市售的胰蛋白酶,其活力都經(jīng)過測(cè)定而有效,但配制時(shí)必須新鮮,需保存在低溫冰箱中,消化時(shí)的pH和溫度都要適宜,否則會(huì)影響活力,細(xì)胞的分散直接與酶的活力有關(guān),最終使用活力為1:2001:25056pH8.0時(shí)活力最好。   
該酶為粉劑,保藏時(shí)要防潮,室內(nèi)溫度不宜過高,保存時(shí)間不能太長,若粉劑結(jié)團(tuán)塊,說明該部分受潮或失效。   
酶的濃度 胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%(活力1:2001:250),但遇到難消化的組織時(shí),濃度可適當(dāng)提高,消化時(shí)間適當(dāng)延長。濃度高對(duì)細(xì)胞有毒性,而較低濃度的胰蛋白酶在培養(yǎng)液中可促進(jìn)細(xì)胞的增殖,若培養(yǎng)液中加入血清,其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。   
溫度 一般認(rèn)為胰蛋白酶在56時(shí)活性最好,但由于對(duì)細(xì)胞有損害而不能被采用,常使用的溫度為37,通常在37進(jìn)行消化比室溫作用快。   
pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力適宜范圍,但隨堿性的增加其活力也隨之減少,活性強(qiáng)分散快,細(xì)胞也容易被消化下來,消化分離細(xì)胞時(shí)PH只能選用7.68.0之間,否則對(duì)細(xì)胞有損傷。   
無機(jī)鹽離子 若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來配制胰蛋白酶時(shí),可以發(fā)生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制時(shí)應(yīng)采用無鈣鎂離子的PBS配制。   
消化時(shí)間 如果細(xì)胞消化時(shí)間過長,可以損害細(xì)胞的呼吸酶,從而影響細(xì)胞的代謝,一般消化時(shí)間為20分鐘為宜,冷消化時(shí)使用低濃度消化液,于4過夜也可。   
分離方法如下:   
過夜冷消化 將取得的組織用Hanks液洗三次,剪成碎塊大小為4毫米左右,用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪組織,再加入0.25%的胰蛋白酶,搖勻后放4過夜,次日再用Hanks液洗滌,棄去上清,共洗2~3次,然后,加入少量營養(yǎng)液吹打分散,細(xì)胞計(jì)數(shù),按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。   
多次提取消化法 多次提取消化法有以下三種:   
熱消化多次提取——將剪碎的細(xì)胞塊加入0.25%胰蛋白酶37水浴中消化15~20分鐘,然后經(jīng)洗滌后用營養(yǎng)液分散制成細(xì)胞懸液,按合適的濃度分瓶培養(yǎng),然后將留下的未全部消化的組織按上述方法操作,再消化提取細(xì)胞。   
冷消化多次提取——方法同上,只是消化溫度為4。   
先熱消化后冷消化——將組織塊先用胰蛋白酶于37下消化20分鐘經(jīng)洗滌后用營養(yǎng)液分散,制成懸液,剩余未消化的小組織塊經(jīng)洗滌后用胰酶于4下過夜,次日再提取細(xì)胞,分散成懸液,分瓶培養(yǎng)。   
2 膠原酶(Collagenase)消化法    
    膠原酶
是一種從細(xì)菌中提取出來的酶,對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織,它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用,對(duì)細(xì)胞本身影響不大,可使細(xì)胞與膠原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好,即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制,即操作簡便又可提高細(xì)胞成活率,最終濃度200u/mL0.10.3mg/mL。此酶消化作用緩和,無需機(jī)械振蕩,但膠原酶價(jià)格較高,大量使用將增加實(shí)驗(yàn)成本。   
   
經(jīng)過膠原酶消化后的上皮組織,由于上皮細(xì)胞對(duì)酶有耐受性,可能有一些上皮細(xì)胞團(tuán)塊尚未被全部消化開。成小團(tuán)塊的上皮細(xì)胞比分散的單個(gè)上皮細(xì)胞更易生長,因此不必要再進(jìn)一步消化處理。   
   
鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生物學(xué)活性(見表4-1)和在不同濃度下消化各種組織小塊所需的時(shí)間(小時(shí))有差異(見表4-2),以及兩者價(jià)格不等,有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用,同時(shí)還可加透明質(zhì)酸酶(對(duì)細(xì)胞表面糖基有作用),采用兩者的聯(lián)合消化作用,對(duì)分散大鼠和兔肝、癌組織非常有效。   
4-1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別   
項(xiàng)                                胰蛋白酶                          膠原酶   
消化特性                         適用于消化軟組織              適用于消化纖維多的組織   
                              0.01%0.5%                  0.10.3mg/mL(200u/mL)   
消化時(shí)間                            0.52小時(shí)(小塊)               112小時(shí)   
pH                                    8
9                            6.57.0   
作用強(qiáng)度                               強(qiáng)烈                                緩和   
細(xì)胞影響                          時(shí)間過長有影響                     無大影響   
血清、鈣、鎂離子                     有影響                           無影響   
4-2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊時(shí)所需時(shí)間(小時(shí))(0.51cm3) 
                                                            
                                  4
   37                   4   37   
胰蛋白酶(0.25%)                  2448 16 12                 1224 12 0.51   
膠原酶(200u/mL)                   24   6   6.5                     12   3   0.25   
兩者聯(lián)合(對(duì)沖)                  1246 1224 412                1224 612 12   
除上述兩種經(jīng)常用的消化酶外,還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶,近年來,還有一種從灰霉菌中提取的Pronase新酶分散細(xì)胞更佳。   
2
、非酶消化法(EDTA消化法)   
EDTA
是一種非酶消化物,又稱螯合劑或Versene,全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液,對(duì)一些組織,尤其是上皮組織分散效果好,該化學(xué)物質(zhì)能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物,利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離,缺點(diǎn)是細(xì)胞易裂解或貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離時(shí)呈片狀,有團(tuán)塊,常不單獨(dú)使用,但可與胰蛋白酶混合使用(1:12:1),不僅利于細(xì)胞脫壁又利于細(xì)胞分散,可降低胰酶的用量和毒性作用。   
消化分離法的操作步驟:   
1)剪切 把組織塊剪碎,呈1~5mm3大小的組織塊。   
2 加液漂洗 將碎組織塊在平皿(或三角燒瓶)中用無鈣鎂PBS2-3次(采用傾斜,自然沉降法)。   
3)消化 加入消化液(胰蛋白酶或膠原酶或EDTA)于37水浴中作用適當(dāng)時(shí)間(中間可輕搖1~2次),若組織塊膨松呈絮狀可終止,若變化不大可更換一次消化液,繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時(shí)間不宜過長。   
4)棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。   
5)漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入,中止消化反應(yīng),采用漂洗法洗2-3次后,加入全部培養(yǎng)基。   
6)機(jī)械分散 采用吸管吹打或振蕩法,使細(xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)或3~4層無菌紗布過濾后分瓶培養(yǎng),若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘,吸上層細(xì)胞懸液進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。   
注意事項(xiàng)如下:   
1)組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對(duì)胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。   
2)胰蛋白濃度不宜過高,作用時(shí)間不能太長,以避免毒性作用。   
3)消化后組織不僅要盡量棄去消化液,以避免毒性產(chǎn)生,而且動(dòng)作要輕,以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。    
三、原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法   
原代細(xì)胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng) 是從供體取得組織細(xì)胞在體外進(jìn)行的第一次培養(yǎng),是建立細(xì)胞系的第一步,是一項(xiàng)基本技術(shù)。原代細(xì)胞因剛從組織中分離開,生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化,仍保留原來的遺傳特性,也很接近和反映體內(nèi)生長特性,適宜用于藥物敏感性試驗(yàn)、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。   
原代細(xì)胞往往有多種細(xì)胞組成,比較混雜,即使從形態(tài)上為同一類型(上皮樣或成纖維樣),但細(xì)胞間仍有很大差異。如果供體不同,即使組織類型、部位相同,個(gè)體差異也照樣存在,原代細(xì)胞生物特性尚不穩(wěn)定,如需做較為嚴(yán)格的對(duì)比性實(shí)驗(yàn)研究,還需進(jìn)行短期傳代培養(yǎng)。   
1
、組織塊培養(yǎng)法   
組織塊培養(yǎng)是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法,也是早期采用培養(yǎng)細(xì)胞的方法,故原先被稱為組織培養(yǎng)。其方法:為將剪成的小組織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶(或皿)中,瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層,以利于組織塊粘著于瓶壁,使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長,方法簡便,利于培養(yǎng),部分種類的組織細(xì)胞在小塊貼壁24小時(shí)后細(xì)胞就從組織塊四周游出,然后逐漸延伸,長成肉眼可以觀察到的生長暈,5~7天后組織塊中央的組織細(xì)胞逐漸壞死脫落和發(fā)生漂浮,此漂浮小塊可隨換液而棄去,由組織塊周圍延伸的貼壁細(xì)胞也逐漸形成層片,可在顯微鏡下觀察形態(tài)和用于實(shí)驗(yàn)研究。  
其培養(yǎng)方法如下:   
(1)
按照前述方法取材,將組織剪成或切成1mm3大小的小塊,并加入少許培養(yǎng)基使組織濕潤。   
(2)
將小塊均勻涂布于瓶壁,每小塊間距0.2 cm~0.5cm,一般在25mL培養(yǎng)瓶(底面積為17.5cm2)可接種2030小塊為宜,小塊放置后,輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,使瓶底朝上,然后于瓶內(nèi)加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞,將瓶傾斜放置在37溫箱內(nèi)。   

(3)
培養(yǎng)2~4小時(shí),待小塊貼附后,將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放,靜置培養(yǎng),動(dòng)作要輕,嚴(yán)禁搖動(dòng)和來回振蕩,以防由于沖動(dòng)而使小塊漂起而造成培養(yǎng)失敗,若組織塊不易貼壁可預(yù)先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開始培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基不宜多,以保持組織塊濕潤即可,培養(yǎng)24小時(shí)后再補(bǔ)液,培養(yǎng)初期移動(dòng)和觀察時(shí)要輕拿輕放,開始幾天盡量不去搬動(dòng),以利貼壁和生長,培養(yǎng)3~5天時(shí)可換液,一方面補(bǔ)充營養(yǎng),一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用。   
原代細(xì)胞培養(yǎng)-2   
2.
消化培養(yǎng)法   
該方法是采用前述的消化分散法,將妨礙細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)(包括基質(zhì)、纖維等)去除,使細(xì)胞分散形成細(xì)胞懸液,然后分瓶培養(yǎng)。   
某些特殊類型細(xì)胞,如內(nèi)皮細(xì)胞、骨細(xì)胞等的消化手段和步驟,將在有關(guān)章節(jié)中敘述。   
3.
懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法   
對(duì)于懸浮生長的細(xì)胞,如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化,可采用低速離心分離,直接培養(yǎng),或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。   
4.
器官培養(yǎng)   
器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后,不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng),其特性仍保持原有器官細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)和聯(lián)系、并能存活,器官培養(yǎng)的目的和技術(shù)均與單層細(xì)胞培養(yǎng)不同,但可利用器官培養(yǎng)對(duì)器官組織的生長變化進(jìn)行體外觀察。并觀察不同培養(yǎng)條件研究對(duì)器官組織的影響。器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對(duì)完整性,可用于重點(diǎn)觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響,以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。體外器官培養(yǎng)為臨床上的organ transplant創(chuàng)造了便利的條件。器官培養(yǎng)的條件與細(xì)胞培養(yǎng)不同,要有特殊的要求。   
1. 
器官培養(yǎng)的特殊的要求   
(1)
需要特殊的培養(yǎng)條件 因器官離體培養(yǎng),其營養(yǎng)和氧氣僅靠自然滲透來供給,因此,培養(yǎng)時(shí)為了確保中心不發(fā)生缺乏氧和營養(yǎng)而造成壞死,其厚度或直徑不宜超過1mm。   

(2)
器官內(nèi)部細(xì)胞需要有足夠的氧氣滲入 常采用以下兩種方法:   
a. 
將器官組織塊置于培養(yǎng)基氣液面以利于氣體交換。   
b. 
提高培養(yǎng)基中的氧分壓,一般需加注純氧,提高氧分壓時(shí)仍需保持5% CO2,以維持pH。   
2. 
器官培養(yǎng)的方法   
(1)
將不銹鋼網(wǎng)做成的支架,放置于培養(yǎng)皿中,高度為1/2皿高,使其表面鋪上0.5mm孔徑的濾膜。   
(2)
將培養(yǎng)基加入平皿中,使培養(yǎng)液剛剛接觸到濾膜,但不要使濾膜浮起。   
(3)
將要培養(yǎng)的器官組織平放在濾膜上,一般厚度不要超過200μm,水平面積不超過10mm2,如為肝、腎不能大于1mm2   
(4)
將培養(yǎng)物置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi),并加注氧氣,調(diào)整氧分壓達(dá)90%,培養(yǎng)時(shí)注意使液面與膜保持在一致的水平上。   
(5)
上述器官培養(yǎng)1~3周(每隔2~3天換液一次)后可用于實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)。   

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