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HL-SAN熱不穩(wěn)定性耐高鹽核酸酶

發(fā)布時間: 2023-11-01  點擊次數(shù): 532次

 


ArcticZymes Technologies成立于20世紀80年代后期,總部位于挪威北部的特羅姆瑟(Troms?)。立足北極海洋區(qū),致力于從海洋生物中識別新的冷適應酶,用于分子研究、體外診斷和治療領域。ArcticZymes專注于與全球的合作伙伴和商業(yè)創(chuàng)新者建立牢固可靠的關系。因此,我們一直在探索并開發(fā)更加不一樣的產品,不斷滿足并且超過合作伙伴的期望。

HL-SAN熱不穩(wěn)定性耐高鹽核酸酶70910-202 

描述

無論是實驗室規(guī)模樣品制備、還是生產規(guī)模工藝過程,去除核酸都可以改善工藝流程,如蛋白純化、病毒載體制備、mNGS中樣品處理等過程。而核酸酶的選擇,就顯得特別重要。Heat Labile-Salt Active Nuclease (熱不穩(wěn)定性耐高鹽核酸酶,HL-SAN) 是一種非特異性內切酶,在高鹽濃度下具有較佳活性;且該酶在多種緩沖液中都有活性,很容易通過還原劑處理而失活。這些特性使HL-SAN在需要去除DNARNA的應用中,更為適合。

核酸污染,特別是宿主基因組DNA污染,在幾乎所有工藝流程及生物制品的生產中,都是需要重點解決的問題。一方面,宿主DNA的存在,影響目標產物的純化及下游質量分析等。另一方面,宿主DNA殘留能引起機體嚴重的免疫反應,是生物制品的關鍵質量參數(shù)之一,FDANMPA等對Host Cell DNA (HCD)有嚴格的質控要求。

宿主基因組DNA中,組蛋白與DNA形成核小體,核小體緊密折疊形成結構復雜的染色質。組蛋白與DNA間存在強烈的離子作用及疏水作用,再加上特殊的結構,導致宿主DNA很難被準確檢測并清除。已有文獻表明,高鹽濃度下組蛋白與DNA解離相對很好,這有利于宿主DNA的檢測及去除。但市售的絕大多數(shù)核酸酶在高鹽濃度下活性很弱,甚至全部失活。而耐高鹽的HL-SAN成了這類應用的理想選擇。

高鹽濃度能夠提高去除效率

HL-SAN是一種新型的、耐高鹽的工程化內切酶。該酶在0.5 M NaCl條件下具有較佳活性,是去除宿主DNA污染的理想選擇。

鹽濃度是去除過程的重要參數(shù)之一。高鹽濃度下,宿主DNA與蛋白質能夠全部解離,從而更容易被降解。

推薦應用

1. 病原微生物診斷應用,如宏基因組測序(mNGS)樣品去除宿主DNA;

2. 蛋白純化,特別是DNA結合蛋白;

3. 病毒載體制備,如腺相關病毒(AAV)、腺病毒(AdV)等;

4. 其他需要去除宿主DNA的應用等。

優(yōu)勢

1. 鹽條件下,DNA清除效率更高,宿主DNA殘留更少;

2. pI9.6,容易跟絕大多數(shù)蛋白分離;

3. 還原劑存在時,酶易失活,減少對后續(xù)流程的影響。

4.溫度穩(wěn)定

5.在低溫下活躍(6℃時為20%

實驗數(shù)據(jù):

img1 

img2 

Figure 1. HL-SAN的特性

使用指導

1. DNA去除方案

從細胞抽提物或細胞裂解液中去除DNA污染,HL-SAN的使用量受到多種因素影響,如細胞類型、裂解液組成、NaCl濃度、Mg2+濃度、裂解液pH等。參考方案見Figure 1。比如,對于1ml細胞裂解樣品,調整到0.3-0.75 M NaCl濃度,加入1000 U HL-SAN,15-37溫度條件下孵育30-60min,或者4過夜。Mg2+是必須的

img3 

Figure 2. 不同樣品、不同去除要求下,HL-SAN的推薦濃度及反應條件。(DNA removal的要求是指通過瓊脂糖凝膠電泳看不到條帶。Decontamination的去除要求是對23S rDNA進行qPCR檢測為陰性。)

2. 滅活

滅活是通過添加還原劑(TCEPDTT)來實現(xiàn)的,推薦用TCEP(因為TCEP在磷酸鹽溶液中不穩(wěn)定,特別在中性pH下)。不同工藝流程中,通過改變孵育時間、溫度和還原劑的濃度等來活該酶。一般情況下, 25-37反應5-10分鐘,可以滅活99%以上的酶。為了避免酶恢復活性、再次激活,保持低濃度還原劑,如0.1-0.5 mM DTTTCEP,或延長滅活反應時間。

3. 去除

HL-SANpI9.6,能夠緊密結合陽離子交換柱。在pH 9.0條件下用0.2M鹽沖洗,柱子的流出液/廢液中只有不到0.02%酶脫落。需要注意的是,不推薦使用陰離子交換柱去除HL-SAN,因為HL-SAN的糖基化修飾會結合到柱子上。

img4 

Figure 3. HL-SAN緊密結合在SP-sepharose柱子上(體系是0.2 M鹽濃度,pH 9.0)。

應用實例:

高效去除人體DNA (99.99%)干擾、快速檢測下呼吸道感染(LRIs)病原

呼吸道感染(RIs)病原的快速檢測一直是醫(yī)療中亟待解決的問題。RIs樣本類型眾多并且病原含量差別很大,同時帶有大量的人體細胞,因此搭建一套快速、高效的樣本處理系統(tǒng)對于通過高通量測序進行病原檢測至關重要。

2019Nature Biotechnology文章報道了如下流程。為了盡可能去除宿主DNA、提高檢測靈敏度,在優(yōu)化實驗的人體宿主細胞去除、微生物DNA提取和nanopore測序等三個步驟都做了對應的優(yōu)化,比如宿主DNA去除時找到了合適濃度的saponin2.2%),HL-SAN步驟由兩步減為一步,清洗步驟縮減為2次。從拿到樣本到建庫完成縮短至6hr,且在較終檢測中達到了96.6%的敏感性和100%的特異性。img5

Figure4. Nanopore宏基因組快檢流程。

熱銷產品

貨號

品名

規(guī)格

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HL-SAN

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500000units

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HL-dsDNase 2-1000

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Cod Uracil-DNA Glycosylase Cod UNG-1-100

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ArcticZymes Proteinase

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北京和生物科技有限公司專業(yè)代理arctizymes全系列產品,專營進口生物試劑,科學儀器,實驗消耗品,化工原料及藥物中間體等。公司與諸多國外品牌簽下代理,sigma、santaRD、AbcamCST、toxin、streck、Biolegendebioscience、saracarepolyplus、Beyotime、Novus、moltox等,能為廣大科研用戶提供數(shù)萬種試劑、儀器和實驗消耗品。

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